virtulab.net Статьи Химия БЕЛКИ И ПОЛИПЕПТИДЫ - ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТРОЕНИЯ БЕЛКОВ

Виртуальная лаборатория ВиртуЛаб

Многие явления и опыты провести в условиях учебного заведения очень сложно или невыполнимо.

БЕЛКИ И ПОЛИПЕПТИДЫ - ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТРОЕНИЯ БЕЛКОВ

Определение строения белков является очень сложной задачей, но за последние годы в химии белка достигнуты значительные успехи. Помимо методов получения высокомоле кулярных синтетических полипептидов, построенных из большого чис ла молекул одинаковых а-аминокислот, разработаны методы синтеза смешанных полипептидов с заранее заданным порядком чередования различных а-аминокислот путем постепенного их наращивания.

Полностью определена химическая структура нескольких белков: гормона инсулина, антибиотика грамицидин, фермента, расщепляющего нуклеи новые кислоты, рибонуклеазы, гормона аденокортикотропина, белка вируса табачной мозаики, миоглобина, гемоглобина и др. Частично определена структура некото рых других белков.

Изучение химического строения белка начинают с определения аминокислотного состава. Для этого используется главным образом метод гидролиза, т. е. нагревание белка с 6—10 моль/л соляной кислотой при температуре 100—110°С. Получают смесь а-аминокислот, из которой можно выделить индивидуальные аминокислоты.

Например, полный гидролиз одного трипептида приводит к образованию трех аминокислот:

Для количественного анализа этой смеси в настоя щее время применяют ионообменную и бумажную хроматографию. Сконструированы специальные автоматические анализаторы аминокислот.

Итак, гидролиз белков, по существу, сводится к гидролизу полипептидных связей. К этому же сводится и процесс переваривание.

Разработаны также ферментативные методы ступенчатого рас щепления белка. Некоторые ферменты расщепляют макромолекулу белка специфически — только в местах нахождения определенной аминокислоты. Так получают продукты ступенчатого расщепления — пептоны и пептиды, последующим анализом которых устанавлива ют их аминокислотный состав.

Значительно более сложным является определение последова тельности амидокислот в пептидных цепях белка. С этой целью пре жде всего определяют N- и С-концы полипептидных цепей, при этом решаются два вопроса—идентифицируются концевые аминокислоты и определяется число пептидных цепей, входящих в состав макромо лекул белка. Для определения N-концов пептидной цепи получают N-производное концевой аминокислоты пептида, которое идентифицируют после полного гидролиза пептида. С-концы пептидных цепей определяются избирательным отщеп лением концевой аминокислоты с помощью специфического фермен та — карбоксипептидазы и последующей идентификацией этой амино кислоты. Если макромолекула белка состоит из двух (или более) пеп тидных цепей, как в случае инсулина, то избирательно разрушают дисульфидные мостики окислением (например, над-муравьиной кислотой) и затем полученные полипептиды разделяют путем фракционирования на ионитах. Для определения последова­тельности расположения аминокислот в каждой полипептидной цепи ее подвергают частичному кислотному гидролизу и избиратель ному расщеплению с помощью ферментов, каждый из которых раз рывает полипептидную цепь только в определенных местах присоеди нения какой-то одной определенной аминокислоты или одного типа аминокислот (основных, ароматических). Таким образом получают несколько наборов пептидов: которые разделяют, используя методы хроматографии и электрофореза. Строение коротких пептидов определяют последовательным от щеплением и идентификацией концевых аминокислот упомянутыми выше методами, а большие пептиды подвергают дополнительному расщеплению с последующим разделением и определением строе ния. Затем путем сложного сопоставления структуры различных уча стков пептидной цепи воссоздают полную картину расположения аминокислот в макромолекуле белка. Работа эта очень трудоемкая, и для определения химической структуры белка требуется несколь ко лет.

Для изучения пространственной структуры белка, последовательности соединения аминокислот в том или ином белке используют различные физико-химические методы, из которых наиболее эффек тивными оказались метод ступенчатого расщепления и рентгеноструктурный анализ.

Рентгеноструктурный анализ - метод исследования атомной структуры в-ва с помощью дифракции рентгеновских лучей. Рентгеновские лучи взаимодействуют с электронными оболочками атомов. В результате этого взаимодейст вия происходит дифракция рентгеновских лучей и на фотопленке получается дифракционная картина — пятна или окружности. Из дифракционной картины при помощи сложных расчетов устанавливают распределение электронной плотности в-ва, а по ней - род атомов и их расположение.

В настоящее время установлено, что большинство белков состоят из 22 качественно разных а-аминокислот.

При образовании молекулы белка или полипептида а-аминокислоты могут соединяться в различной последовательности. Возмож но огромное число различных комбинаций. Так же как, пользуясь 20...30 буквами алфавита, можно написать текст любой длины, так и из 20 а-аминокислот можно образовать больше 1018 комбинаций. Существование различного типа полипептидов практически неогра ничено.